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单细胞转录组的绝对缩放揭示成体干细胞和祖细胞中普遍存在的超转录

Yun-Kyo金,米格尔Ramalho-Santos

预印本发布于2021年12月13日https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.12.13.472426v1

定量单细胞的绝对RNA含量是可能的现有数据集和生物学相关。

选择 凡妮莎Luzak

简介

单细胞RNA-seq (scRNA-seq)是测量单个细胞中基因表达的强大工具。虽然相对基因表达差异目前在单细胞数据中分析,但总转录水平的差异主要被认为是技术人工制品,在标准化过程中被移除,假设单个细胞含有相似数量的总RNA。

在本预印本中,金.旨在研究当前的scRNA-seq协议是否可以用于测量单个细胞的总转录水平。通过使用一个在发育过程中增加总转录量的细胞的生物学例子(称为“超转录”),作者能够验证细胞间总转录水平的差异主要不是由于技术人为因素。相反,这些差异可以在现有的scRNA-seq数据集中使用UMIs和/或ERCC峰值进行量化,并具有生物学意义。当作者将他们的工具应用于成年小鼠器官的scRNAseq数据时,他们能够证明超转录并不是一种局限于发育过程中特定细胞类型和时期的罕见程序。相反,他们发现这是一个相当普遍的生物过程,发生在对生物量有很高需求的细胞中。

术语“超转录”的定义:

在发育过程中,超转录已经被不同类型的特定细胞所描述。在超转录细胞中,转录速率和转录水平普遍升高,伴随着染色质的全面开放,染色质重塑器和一般转录扩增物(如Myc蛋白家族成员)的高活性。作为一个标志,由GO术语概括的基因“染色质重塑”,“DNA修复”,“核糖体生物发生”和“翻译”在超转录期间表现出特别高的转录水平。

调查结果摘要

在这项研究中,没有产生新的scRNAseq数据。相反,我们使用了之前发布的scRNAseq数据集。

为了这个总结,选择关键实验进行了描述。更多的支持性数据可以在预印本中找到。

步骤1:使用ERCC spike或UMIs(体外设置)可以实现RNA水平的绝对缩放

问题:使用UMIs或ERCC激增?

UMIs:首先,作者分析了先前发表的“scRNAseq调酒”实验的数据。在本实验中,将提取的mRNA制备为稀释系列,每个样品中都有已知数量的mRNA。对UMI计数的绝对缩放正确地检测了稀释系列样品之间总mrnaba的定义差异。

ERCC spike in:“scRNAseq mixology”实验中的mRNA稀释序列也通过绝对缩放到ERCC spike in成功检测,除了UMIs外,实验中还使用了ERCC spike in。

一般来说,缩放到ERCC峰值比缩放到UMI计数更精确。对于体外对照实验,以及下面描述的使用来自生物样本的scRNAseq数据的实验,都是如此。然而,这两种方法都很有效。

答:是的,可以通过对UMIs或ERCC峰值的绝对缩放来检测确定的RNA水平差异。

步骤2:绝对标度可以识别先前生物样本中特异的超转录病例

问:在生物scRNAseq样本中,总RNA水平的差异能否被检测出来?

实验1:胚胎小鼠干细胞(mESCs)在两种不同的条件下生长,然后将细胞混合并由10x Genomics进行分析。条件一(血清/LIF)诱导超转录,而条件二(双重GSK/MEK抑制)诱导低转录。使用UMI计数,绝对缩放可以成功地检测出血清/LIF生长的细胞中发生超转录的总转录水平较高。

实验2:分析小鼠性腺发育期间(从E11.5到P5)的10倍基因组学数据。原始生殖细胞(PGCs)先前被描述为在E12.5和E14.5左右有丝分裂扩张期间发生超转录。事实上,对UMI计数的绝对缩放可以在指定的时间段内特异性地检测PGC细胞(而不是其他细胞类型)的超转录。

答:是的,总RNA水平的生物学差异可以通过绝对缩放来检测。

步骤3:绝对尺度将超转录确定为成年生物的一般生物过程

问:过度转录是否局限于特定的细胞类型和时期发展吗?

实验1:Tabula Muris图集包含20个不同小鼠器官的scRNAseq数据。大多数器官已通过两种不同的scRNAseq方法进行分析,即10x Genomics(包括UMIs)和SmartSeq2(包括ERCC Spike ins)。使用绝对缩放方法来分析Tabula Muris数据集,作者可以证明这一点

  • 低转录水平主要出现在分化的细胞类型中。
  • 在增殖干细胞和祖细胞、多倍体细胞和分泌细胞中检测到高转录水平。
  • 沿着分化轨迹,超转录逐渐消失。
  • 在对生物量有高需求的细胞中,如干细胞、祖细胞和分泌细胞中检测到超转录的特定特征(见导论中的定义)。

实验2:使用损伤后器官再生过程中记录的两个scRNAseq数据集,作者可以证明超转录在这一动态过程中发挥作用。在第一组数据中,在心脏毒素诱导的骨骼肌损伤后不久,卫星干细胞的超转录被激活,这在骨骼肌再生中起着关键作用。在第二个数据集中,辐照诱导的肠损伤后,Clu+复苏干细胞的超转录被激活。综上所述,两组数据表明超转录在器官再生过程中起着重要作用。

答案:不,超转录并不局限于发育。它发生在发育过程中,以及在成年生物中,作为对生物量有高需求的细胞的一般生物过程。

主要学习

技术性:单细胞总转录水平的定量是可能的。

使用UMIs和/或ERCC峰值,可以在数据集中实现scRNAseq数据的绝对缩放。

生物学:单细胞总转录水平的定量是生物学相关的。

测量单细胞的绝对转录水平揭示了成人器官中一个被忽视的但基本的转录程序:在对生物量有高需求的细胞中发现了超转录,例如器官维持和再生期间的多能增殖细胞,以及分化的分泌细胞。

个人观点-为什么这项工作很重要

金的研究et al。为scRNAseq数据集一个被忽视但常见的方面提供了潜在的生物学意义:对于单个细胞,可以检测到完全不同数量的转录本。这是第一次表明,总RNA水平的这种差异不是纯粹的技术人为因素。在我看来,他们的绝对缩放方法应该经常用于scRNAseq数据集的未来分析。非常方便的是,现有的实验设置不需要任何改变,甚至现有的数据也可以很容易地重新分析。

我很惊讶,通过更仔细地观察现有的数据集,我在这项研究中产生了多少新知识。在成人器官中,超转录被认为是一种普遍的细胞程序,可能被用作分化过程中的一种标记。此外,作为一名研究单细胞真核生物的研究人员,我很想知道高转录是否也发生在单细胞生物中并与之相关?

发布时间:2022年3月29日

doi:https://doi.org/10.1242/prelights.31707

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对作者的问题

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问:对于将来的scRNAseq实验设置有什么实用的指导方针吗什么时候应该测量总转录水平?

我们研究的主要目标之一是评估是否可以从现有的scRNA-seq数据集中获得关于总转录本内容的信息,答案是,如果使用ercc或UMIs,通常是可以的。这两种方法都有效,尽管ERCC spike-ins能更好地重现真实的mRNA转录水平,并且在测序深度方面比UMIs更稳健。后续实验可以包括我们和其他人之前描述的细胞数标准化方法(Percharde et al.,细胞发育2017),并且可以在感兴趣的细胞群体中进行(例如,ercc标准化的散装RNA-seq或5-EU掺入分析)。

如何区分转录水平的变化是由于技术原因还是由于以前未被描述的生物系统中的生物学原因?你能不能确定仅由于技术原因而导致转录水平变化的范围,这是否可以用作一种阈值?

我们没有确定一个主要以技术差异为特征的特定转录本范围,尽管应该注意的是,绝对转录本内容往往会因数据集和实验设置而略有不同。需要考虑的一个有价值的特征是,在高转录人群中,转录本含量的升高并不孤立地发生。相反,我们目前和以前的研究表明,各种分子参与者,包括双链断裂修复因子、核糖体蛋白和染色质重塑蛋白倾向于差异表达,以促进超转录。此外,在新生转录水平上的整体上调是超转录发挥作用的一个强有力的指标。因此,假设所有其他质量控制都充分完成,我们将鼓励研究人员在评估系统中超转录的存在时参考这些相关的生物线索。

Q3:是否有证据证明所观察到的超转录谱只由增加的全局转录产生?或者,某些RNA富集组是否可能通过减少RNA降解而进一步稳定,例如通过转录后修饰?

虽然我们看到了超转录是由新生转录的整体上调驱动的明确基础,但预计转录后过程也在超转录中发挥重要作用。事实上,我们已经证明,小鼠胚胎干细胞的超转录需要翻译输出,因为新生转录的关键调节因子是不稳定的蛋白质(Bulut-Karslioglu et al.,细胞干细胞2018)。Santos实验室正在进行的一些研究进一步支持了这样一种观点,即全球转录输出的调节整合了新生转录、mRNA稳定性和翻译。我们相信,我们的研究证明了超转录过程潜在的广泛相关性,并希望它能刺激其他实验室在多种情况下也探索这些和其他机制问题。

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