使用crispr定向整合酶进行无DNA切割的拖放基因组插入

背景/介绍

通过CRISPR-Cas9进行基因编辑在生物和医学科学中具有广泛的潜力，但目前的技术在插入大DNA序列方面效果有限，特别是在敏感细胞类型和细胞状态中。

通过标准的CRISPR-Cas9编辑将感兴趣的序列整合到细胞的基因组DNA中，需要Cas9内切酶诱导双链断裂(DSB)，并激活细胞的同源定向修复(HDR)通路以响应损伤，以促进序列整合。然而，在细胞周期的大多数细胞和阶段，非HDR通路(例如非同源端连接(NHEJ))占主导地位，在非分裂细胞中，HDR在很大程度上是不活跃的，使得有效的整合几乎不可能。此外，所有基于dsb修复的方法都容易出错，导致插入或删除(indels)， DNA易位和细胞凋亡通路的激活，这些都是不希望出现的结果。

2019年，随着Prime Editing(1)的开发取得了重大进展，该技术将修饰过的Cas9 nickase融合到逆转录酶(RT)酶和Prime Editing guide RNA (pegRNA)结合在一起，后者既能将Cas9引导到目标位点，又包含要插入的DNA序列。Cas9切割酶在靶点处诱导位点特异性单链DNA断裂。然后pegRNA的3 '端通过引物结合序列与打开的DNA“皮瓣”结合，RT(一种rna依赖的DNA聚合酶)创建pegRNA序列的补体(包括所需的编辑)。这条新创造的链含有与现有的旧DNA序列的微同源性，并取代了它。该系统允许高效的基因编辑，而不需要潜在的有毒DSB。虽然改变了游戏规则(2)，但启动编辑仅限于pegRNA中编码的相对较小的DNA变化(最大80bp)。因此，它可以引入小片段或修复与疾病相关的突变，但不能插入全长基因。

由Ionannidi, Yarnall, Schmitt-Ulms及其同事所做的预印本旨在简化和加速大DNA片段的插入，特别是在非分裂细胞中。他们开发了PASTE(通过Site-specific Targeting Elements可编程添加):一种改进的CRISPR-Cas9系统，它建立在Prime Editing的基础上，并添加了重组酶(特别是丝氨酸整合酶，它催化外源DNA的切除和整合(3))，以实现大型DNA货物的插入。

重要发现

PASTE系统的开发

作者着手将Prime Editing的功能与整合酶(重组酶的一个子集)的特定序列整合能力结合起来。他们将丝氨酸整合酶Bxb1与现有的Cas9切割酶和RT酶融合(又名Prime Editor)。在Prime Editing中，Cas9切割酶诱导单链断裂，RT酶用pegrna编码的序列取代原始DNA序列。然而，使用PASTE系统，pegRNA反而插入了一个AttB丝氨酸整合酶识别位点(这里称为atgRNA)。该DNA序列作为Bxb1的信标，Bxb1以单向方式将任何相应的AttP DNA片段重组到该位点(图1A + B)。使用PASTE，包含单个AttP的环状DNA序列被共同转导到细胞中，驱动整个片段的插入。

PASTE系统的扩展

虽然Cre是最广泛使用的重组酶，但它的DNA整合能力有限，因为重组是双向的，这意味着它可以重复。相比之下，像Bxb1这样的丝氨酸整合酶(在本研究中使用)是单向的，一旦重组，识别序列就不再被酶访问。一个额外的优势是特定的AttB/AttP序列对可以用于独立和并行(正交)重组。作者通过证明Bxb1支持至少4种不同的AttB/AttP变异来强调这一点，以允许在同一细胞中同时发生遗传整合事件(图1C)。

新型丝氨酸整合酶的鉴定

尽管丝氨酸重组酶具有优势，但很少有人对人类细胞中的DNA整合进行了描述。在这里，作者挖掘了现有的宏基因组数据，以寻找新的重组酶。他们确定并测试了包括bcincc在内的一些候选病毒，bcincc起源于粪便样本。在PASTE系统中测试时，这种重组酶的效率比Bxb1提高了2-3倍。然而，模式生物基因组中伪位点的存在或其他脱靶整合在他们的分析中没有被涵盖。

在非分裂细胞或原代细胞中起作用的

为了证明PASTE是多功能的，作者在几种生理相关的细胞类型中测试了它的功能，包括原代人T细胞和静止肝细胞。虽然效率远低于细胞系(~5% vs. ~30%)，但从细胞/基因治疗的角度来看，这对挑战细胞类型是一个巨大的进步。

帮助简化PASTE结构设计的工具

作者根据他们对PASTE事件的大量分析，建立了一个管道来帮助选择或设计atgRNA。然而，该工具还没有图形界面，这可能会降低一些实验室的可访问性。

为什么这篇论文很有趣?

作者在这项研究中进行了几项技术创新，显示出PASTE系统的广泛潜力。他们首次展示了高达36 kb的大型DNA货物的高效靶向整合，涵盖了人类和小鼠基因组中大多数已知的编码序列，以及三个不同基因在不同位点上的串联整合。通过克服细胞中活跃的DSB DNA修复途径的需要，他们能够将基因插入到各种难以编辑的细胞类型中，增加了未来的基因编辑应用。

这篇手稿的另一个有趣的方面是发现了在HEK293FT细胞中活跃的新型丝氨酸整合酶。通过优化AttB序列，与基于bxb1的PASTE相比，他们能够增强bcincc的重组酶活性。尽管作者关注的是PASTE系统内的重组酶效率，而不是单独的重组酶，但这些新型整合酶的发现可能对其他分子生物学应用有用。

这个预印本并不是BioRxiv今年11月发布的唯一重要的基于基本编辑的工具。David Liu的实验室(原始技术的发明者)现在开发了twinPE，它使用2个pegRNA序列来提高效率，与标准的素编辑相比，增加插入/删除/反转/替换的大小。该团队还将twinPE与丝氨酸整合酶Bxb1(在这种情况下作为一个单独的蛋白质)结合，插入5kb序列，并使用联合技术介导导致Hunter综合征的基因的40kb反转(4)。

参考文献

1. Anzalone, a.v.， Randolph, p.b.， Davis, j。ret al。没有双链断裂或供体DNA的搜索和替换基因组编辑。自然576, 149-157 (2019)https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4
2. 斯克尔菲尔德，J，哈里森，P.T. Prime编辑-现场更新。其他基因28, 396-401(2021)。https://doi.org/10.1038/s41434-021-00263-9
3. 卢瑟福，K和范杜恩，GD。丝氨酸整合酶位点特异性重组的来龙去脉。Curr Opin结构生物学125-131(2014)。doi: 10.1016 / j.sbi.2014.01.003
4. Anzalone,A.V,高， X.D, Podracky, C.J，et al。可编程的大DNA删除，替换，整合，倒置与双素数编辑和位点特异性重组酶。BioRxiv(2021)https://doi.org/10.1101/2021.11.01.466790

给作者的问题

1. 新发现的bcint整合酶是否像Bxb1一样是单向的?在人类/小鼠基因组中是否存在伪识别位点?
2. 预印本强调了使用基于DSB的基因编辑的副作用。PASTE会产生单链刻痕，但作者是否评估了与这些相关的损伤/应激反应?
3. 作者是否测试了PASTE，或计划在有丝分裂后的细胞类型(如终分化细胞或3D培养)中测试它?
4. 一旦整合酶插入了感兴趣的转基因或序列，插入的序列两侧仍然保持AttL/AttR序列。作者是否提出了这些基因组伤疤对治疗性基因整合的任何后果，如对基因调控、转录、剪接等的影响?
5. 如果插入异色区，作者是否期望表达“PASTE-ed”序列?

标签:crispr，基因编辑

发布日期:2021年12月15日

doi:https://doi.org/10.1242/prelights.31163

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