利用液滴微流体富集肠道微生物组菌株以进行免培养基因组测序

安娜Pryszlak,托比亚斯策尔，基利西塞茨，福克·希尔德布兰德，欧洲经委会，马可·拉斐尔·科森扎弗拉基米尔•贝奈斯皮尔·博克，Christoph莫顿

预印本发布于2021年6月02日https://arxiv.org/abs/2106.01455

微流体芯片使单细胞和无培养的肠道微生物菌群基因组测序成为可能

选择阿方索·门德斯

类别：生物化学，生物工程，生物信息学，细胞生物学，遗传学，基因组学，微生物学，分子生物学

图1 -开发框架的概述。一个微流控芯片(左上)被设计用来产生由油和水细胞悬浮液产生的乳化液滴。使用生物素化引物进行“芯片外”的液滴PCR，以检测目标DNA序列的存在;阳性结果会产生荧光信号(上中)和生物素化的扩增子。然后将这些液滴重新注入一个分选芯片，该芯片的设计目的是生成富集在正液滴中的样本(右上)。最后，使用链霉亲和素偶联磁珠清除样品的扩增子，并用于全基因组扩增和测序。改编自预印本的图1。

背景

肠道微生物群包含至少几千种[1]，与100多种人类疾病或综合征有关[2-5]。此外，它通过影响药物代谢而影响药理学干预的成功[6,7]。微生物组研究通常涉及大量类群的宏基因组组装基因组(MAGs)的重建，这些基因组易于嵌合组装。微流控液滴筛管可以通过实现单细胞分析来克服这个问题。然而，由于无法培养获得合适样品所需的天然分离菌，这种方法受到了严重的限制。使用微流控液滴的免培养方法可以产生单个扩增基因组(sag)[8,9]，但缺乏绘制感兴趣的特定基因所需的特异性。液滴数字PCR可以提高检测的特异性，但迄今尚未用于粪便样本中复杂微生物群落的研究。该预印本报告了一个框架的发展，使粪便样本中的基因组片段无需培养测序，以恢复高质量的基因组。

主要发现

1-开发一种免培养的分析方法，能够从复杂的样品中提取高质量的基因组

该框架的第一步是生成含有单个细菌细胞的液滴(图1，左上)。这是通过一种微芯片来实现的，这种微芯片可以产生油滴来封装水细胞悬浮液中的单个细胞。“芯片外”液滴PCR使用生物素化引物检测特定细菌种类或菌株的存在;由于序列特异性TaqMan探针的存在，阳性液滴变得荧光(图1，顶部中心)。然后将这些液滴注射到第二块微芯片中，该微芯片的设计目的是将阳性液滴分类成富集了目标序列基因组DNA的大样本(图1，右上角)。使用链霉亲和素偶联磁珠(图1，下)清除大量样品的扩增子，并用于基于测序的基因组重建。

使用对照样品进行分析优化和验证

粪便样本中的细菌细胞密度通过使用非特异性DNA染色（Syto BC）的流式细胞术进行定量。从鸟枪宏基因组数据中直接获得单拷贝非16S核糖体RNA标记基因序列，以定量测定样品中分类群的相对丰度。然后，针对标记序列设计引物对和TaqMan探针，以针对不同的微生物菌株。TaqMan探针信号的特异性通过粪便样本和几种分类群的培养混合物进行验证。对每个目标生物体的几种替代序列进行了测试，预印本的表1中提供了性能最好的序列。

然后将先前确定的细胞密度稀释至最大限度地生成含有单个细胞的液滴的比率，估计每4个液滴中有1个细胞。结果通过荧光显微镜和定制的ImageJ宏确认。该分析产生的荧光阳性单细胞液滴的效率相对于理论最大值为80%，考虑到每个液滴产生的细胞数的泊松模型。

采用不同比例添加枯草芽孢杆菌实验室分离物的粪便样品，通过经验测定荧光阈值，仅通过PCR或显微镜观察到阳性液滴。

基于pcr的检测方法的结果是，样品在扩增子中富集，成为包含单个基因组拷贝的液滴中最丰富的DNA片段。使用生物素化的PCR引物可以规避这一警告，该引物可以使用链霉亲和素结合的磁珠从液滴池中去除扩增子。使用这种方法，在三轮珠纯化后，扩增产物的水平无法检测到，而在Illumina测序库制备过程中，DNA扩增后的水平仍保持不变。液滴中的热循环产生的基因组DNA片段大小(300至3000 bp)适合于测序库的准备，不需要额外的碎片步骤。重要的是，作者们确定，使用开发的框架，只可以从4000个细胞中检索高质量的基因组。

3-从临床样本中检索内源性细菌的高质量从头基因组

在前面描述的基准步骤之后，该框架被应用于内源性粪便细菌b . vulgatus在同一份粪便样本的两份等量中。

对样本进行目标细菌分类，并收集相应的测序数据（图2A和2B）。

高品质的基因组来自各等份样品检索。CheckM [10]用于计算基因组“完整性” 89％的分数和99％为1％以下每个基因组和污染水平。收集到的数据的高品质进一步证实比较参考基因组（图2C）。

**图2 -本试验对内生普通杆菌的应用。** **(一)**从两份粪便样本中分离出阴杆菌阳性液滴并进行测序。完整性得分分别为88.78%和99.25%，污染得分低于1%。**(B)**FACS绘图和叠加亮场/荧光显微镜图像显示分选结果。**（C）**从样本中获得的基因组序列与参考基因组的比较表明，它们的覆盖率很高。改编自预印本的图4。

为什么我认为这项工作很重要

在过去的几年里，大量的研究为肠道微生物群对个人健康的影响提供了深入的见解。肠道微生物的种类组成往往与其功能特性有关。因此，了解如何通过某些条件或医疗干预来调节这一组成，对改善人口健康很重要。然而，由于微生物组的分类复杂性和无法培养大多数内源性菌株，确定分类的相对丰度和从临床样本中以精确和可重复的方式恢复感兴趣物种的高质量基因组是困难的，目前的方法。

在这个预印本中，作者开发了一种分析方法，通过结合几种前沿技术的优势来克服这些限制。重要的是，它们提供了所开发框架的详细描述和正确实现的指令。

给作者的问题

1 -您的新方法可以对肠道微生物进行免培养的工作，而临床试验通常需要培养。与基于培养的替代方法相比，您如何设想像这样的无培养方法对感兴趣的微生物群的目标分析的作用?

2 -一个可行的方法来描述个体的微生物群是精准医疗的重要一步。你认为我们离在临床环境中实施你的框架还有多远?

参考

作者简介:王志强，男，博士。人类肠道微生物群的新基因组蓝图。《自然》568,499-504(2019)。

Nobu, M. K.等。微生物暗物质生态基因组学揭示了产甲烷生物反应器中复杂的协同网络。(2015)。

粪便微生物菌群移植:展望。theradv Gastroenter 9,229 - 239(2016)。

Louis, P.， Hold, G. L. & Flint, H. J.肠道微生物群、细菌代谢产物和结直肠癌。微生物学报12,661-672(2014)。

[5]沃斯，W. M.德＆沃斯，E. A.德。肠道微生物的作用，在健康和疾病：从相关因果关系。营养学启70，S45-S56（2012）。

Zimmermann, M.， Zimmermann- kogadeeva, M.， Wegmann, R. & Goodman, A. L.通过肠道细菌及其基因绘制人体微生物组药物代谢图谱。《自然》570,462 - 467(2019)。

[7]齐默尔曼，M.，齐默尔曼-Kogadeeva，M.，维格曼，R。＆古德曼，A. L.分离主机和药物药代动力学和毒性微生物的贡献。科学363，eaat9931（2019）。

[8] Chijiiwa，R。等人。未培养的细菌的单细胞基因组学揭示了在小鼠肠道菌群的膳食纤维反应者。微生物组8，（2020）。

[9]兰，F.，Demaree，B.，艾哈迈德，N。＆阿巴特，在超高通量与微流体液滴条形码A. R.单细胞基因组测序。纳特生物技术35，640-646（2017）。

[10] Parks, D. H.， Imelfort, M.， Skennerton, C. T.， Hugenholtz, P. & Tyson, G. W. CheckM:评估从分离物、单细胞和宏基因组恢复的微生物基因组的质量。中国生物医学工程学报，2015,35(3):457 - 461。

标签：滴，基因组，基因组学，肠道微生物组，微流控，单个细胞

发布于2021年6月24日

内政部：https://doi.org/10.1242/prelights.29645

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托比亚斯·温泽尔分享

1 -你的新方法可以使肠道微生物群无需培养，而临床试验通常涉及培养。您如何看待像这样的无培养方法与基于培养的替代方法在有针对性地分析感兴趣的微生物群方面的作用？

经常有对不问题的一个简单的答案，当涉及到复杂的微生物。许多不同的分析工具（种植为主与否），测序技术和数据分析管道还是有自己的优势取决于研究的问题，样品，以及可用资金。我们很荣幸能有帮助的方法添加到现有的剧目。其中，使得它可以从单个样品恢复感兴趣的特定生物的高品质基因，即使类群不是很充裕，而且不依赖于偶然。

有一些重要的生物和临床问题是特别难以与基于栽培的技术答案，例如，它可移动的遗传因素（通常编码抗生素抗性和其他重要的基因），你在你的身体携带和重要的有机体与其相关（其中许多是不会在实验室中生长）。这是一个唾手可得的使用我们的免费培养的方法来针对移动元素。

但以培养为基础的技术也有许多优点，例如，在功能分析后，可以将样本分裂以进行测序(=杀死细胞)，并保留另一半供进一步分析。总而言之，我认为无培养方法需要回答一些重要的问题，但它们在实践中可能还没有得到应有的广泛应用。但这两种方法类型都存在。

2 -一个可行的方法来描述个体的微生物群是精准医疗的重要一步。你认为我们离在临床环境中实施你的框架还有多远?

这是一个很好的问题，答案在很大程度上取决于人们对这个话题的关注程度。现在是一个激动人心的时刻，许多微流控应用最终转向临床和工业应用，不仅由于芯片设计的成熟，而且试剂和工艺知识。不幸的是，这种开发很少关注微生物群，而用于真核生物工作流程的“一键式仪器”(我喜欢称之为商业集成设备盒)通常不适合微生物群。

同时，研究实验室中的定制微流控工作流程（如此）在设置和培训方面非常复杂，需要一些相对昂贵的设备。我的愿景是使这些工作流程至少在全球范围内更容易为处理临床样本的研究实验室所访问，如果还没有用于临床桌面本身的话。在Wenzel实验室，我们不仅通过开发新的微流控方法，而且通过我们的开源硬件开发来实现这一目标，这使得实验更容易访问、自动化、可复制、价格合理、更有趣。