用于活细胞成像和蛋白质亲和力捕获的多功能荧光团

Pratik Kumar杰森·d·Vevea埃德温·r·查普曼卢克·d·Lavis

预印本发布于2022年7月03日https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.07.02.498544v1

你好，这是你要找的标签吗?@zhanghe_goh重点介绍了@prat_i_k， @JasonVevea， @rhodamine110等人在多功能探针“罗丹明作为链接器”策略上的工作

选择张郃吴

预印本的背景

自标记标签是化学生物学中重要的探针。它们与确定的配体基以特定的方式反应，并与其他功能反应，从而促进广泛的应用。例如，它们可以与荧光染料结合(图1一个)，使研究人员能够观察蛋白质。另外，这些标记也可以绑定到亲和标记(图1 b)，使研究人员能够使用色谱法纯化蛋白质。

图1。标签在生物学中的常见用途。

然而，目前研究人员使用的自标记标签系统有两个关键的限制。首先，为这些自标记标签设计的配体是特定应用的，比如可视化或纯化蛋白质。其次，也许更重要的是，这些标签系统对它们的特定应用进行了高度优化。因此，这些工具的修饰可能会改变重要的性质，如细胞通透性和配体的标记动力学。它们甚至可能显著改变所得到的蛋白质缀合物，但在蛋白质缀合物应尽可能与天然蛋白质相似的情况下，这些变化通常是不可取的。

在本预印本中，库马尔et al。通过制造细胞透性探针，使用罗丹明荧光团作为自标记标签配体的连接剂(图2)．作者假设，在同一配体上同时拥有罗丹明荧光团和亲和试剂将促进快速标记动力学，并改善配体的性质(如细胞通透性)，同时也可以使用荧光成像在细胞内可视化这些标记。

图2。如本研究所述，将荧光和亲和标记功能结合到单个探针中。

本预印本的主要发现

作者首先评估了含生物素的HaloTag配体，这是一种在生物群落中广泛使用的化学探针，由于其快速标记动力学和高细胞通透性。¹通常，HaloTag配体由小分子通过连接器连接到一个功能片段。作者发现，商用生物素- halotag配体具有适度的膜渗透性，在微摩尔浓度下是一个有效的标记。然而，他们也发现连接子太短，导致结合物无法与链霉亲和素结合;链霉亲和素是一种常用的试剂，可以在纯化系统上捕获这些蛋白，因此需要该蛋白能够与链霉亲和素结合，通过亲和纯化来纯化。作者推断，增加连接子的长度可以解决这一问题，但产生的探针反而表现出降低细胞通透性。

为了克服这个问题，库马尔et al。构建了一系列结合罗丹明连接剂和生物素功能的探针;选择罗丹明连接剂的细胞通透性、亮度和光稳定性。然后将这些探针的活动与它们的类似物进行比较，作为对照。

最后，作者在细胞实验中测试了这些染料的生物素缀合物。他们比较了生物素-罗丹明结合物与其未取代的亲本罗丹明染料的荧光特性，然后测量了通过细胞裂解和捕获标记的效率。优化过程使作者专注于两种具有强信号强度、快速标记动力学和中等捕获效率的探针。

我喜欢这个预印本的原因

我要强调的是库马尔的作品et al。因为它描述了作者在多功能染料设计中的“罗丹明作为连接剂”的策略。具体来说，作者描述了这些配体的合成，优化了它们的成像化学性质，并证明了它们与后续亲和纯化的正交性。通过采用这种策略，化学家和生物学家可能会创造出新的配体，这些配体可以作为更多种功能的探针。这也可能有助于创造具有多种纯化方法互补的新一代多功能配体。

未来的发展方向

这些探针的潜在用途在于生物靶的研究。当今医学界最感兴趣的一类生物靶标是蛋白质:²这种探针系统将允许研究人员标记感兴趣的蛋白质，并使用荧光对其进行可视化，以了解其在细胞内的定位。随后，标记的蛋白质就可以被分离出来进行进一步的研究，例如涉及其结构的研究。这些实验将有助于研究人员从机械上确定这些蛋白质的结构和它们的活性之间的关系。从长远来看，这一知识将为蛋白质设计提供信息，并促进人工酶的设计和发明。

事实上，这些探针的用途可能超出蛋白质组学的应用范围。它们还可以用来理解其他有趣的大分子，比如DNA，甚至RNA和脂类，这可能更具挑战性。

此外，除了自标记标签，还有多种标记策略，¹因此，这些多功能探针设计策略也可以应用到其他系统中。将多种功能安装在同一个探针上的想法可能会产生相互正交的标记系统，从而使研究人员能够探测日益复杂的生物系统。

问题的作者

你写的是标准PEG₂商用生物素- halotag配体中的连接子太短，不能使结合物与链霉亲和素结合。你能详细说明一下你是如何从捆绑实验中得出这个结论的吗?例如，它是一个确定的限制配体与短连接;是否有一种替代方法是，合成的共轭物经过充分的结构修饰，使生物素没有充分暴露于链霉亲和素以促进结合?

参考文献

《化学已死》。化学万岁!生物化学2017，56(39)。
桑托斯,r;Ursu o .;Gaulton, a;盒饭,a p;Donadi r s;Bologa, c . g .;Karlsson, a;Al-Lazikani b;赫西,a;电脑,t . i; Overington, J. P., A comprehensive map of molecular drug targets.《自然评论》药物发现2017，16(1)。