PHYTOMap:植物组织中多重单细胞三维空间基因表达分析

背景:

为了最终理解基因在组织和器官环境中的功能，不仅要量化单个细胞中的基因表达，而且要确定这些细胞在完整组织中的个别位置，这是至关重要的。植物中用于聚集RNA测序(RNAseq)的特定细胞分离始于21世纪初，例如，使用激光捕获显微解剖在直接显微镜可视化下用激光束切割和分离感兴趣的组织，通过荧光激活细胞分选(FACS)捕获细胞子集，或分离单个标记的细胞核(完整的)(Asano)et al。, 2002;伯恩鲍姆et al。, 2003;迪尔和海尼科夫，2011年)。随后开发的单细胞RNAseq (scRNAseq)技术在2009年首次应用于小鼠原始生殖细胞，并在几年后适应于在植物中使用，使用分离的原生质体，这些原生质体是在显微镜下根据荧光报告器手动收集的(Tanget al。, 2009;Brenneckeet al。, 2013;Efroniet al。, 2015)。

scRNAseq允许将细胞划分为具有相似转录组特征的细胞群，从而能够识别某些细胞类型，如表皮细胞。然而，由于样本细胞被从它们的组织环境中移除，这些种群的所有位置信息都丢失了。这使得对不包含特定标记基因的细胞群进行分类和分析具有挑战性，例如在研究不如常见模式植物拟南芥深入的植物中。此外，如果实验条件只影响群体中的一个细胞子集，例如通过某种治疗，那么就必须知道这些受影响的细胞位于哪里，以及它们是否在群体和组织中形成了一个空间受限的集群。

为了准确解释scRNAseq数据，需要将观察到的单个细胞的转录组反应映射回完整的组织。迄今为止，空间可视化基因表达最常见的技术在足底是使用表达感兴趣基因的转录报告蛋白的转基因系。然而，转基因报告系的建立是费时和繁琐的，对一些植物品种甚至不可能。另一种适用于所有植物的经典方法是RNA原位杂交，即感兴趣的mRNA直接被抗体检测到的RNA探针靶向。然而，仅绘制单个基因的转录图不足以描述scRNAseq实验中观察到的一个细胞群。空间转录组学，通过使用空间条形码阵列或单分子荧光原位杂交具有挑战性，因为它们需要单细胞层或薄切片，这在植物组织中是费力的，并可能由于切片而再次插入伪影。此外，使用这些技术，组织环境的信息会丢失。

理想情况下，大量基因的空间基因表达分析将在完整的组织环境中以最小的人力和资金需求以单细胞分辨率同时进行。虽然这听起来可能是虚幻的，但在这里突出的出版物中，Nobori等．试图用他们的phytommap来做到这一点^{nyTM *}该方法可以在单细胞水平上对整个植物组织中多个基因的表达进行空间定位，而不需要创建转基因植物株系(Noboriet al。, 2022)。他们为拟南芥根尖开发了一种协议，并通过测绘已建立的标记基因的基因表达，并将其表达整理到scRNAseq数据集，验证了他们的方法。

如何PHYTOMap^nyTM生产:

生成植物地图^nyTM，根组织是固定的和渗透性的，就像整个挂载RNA一样原位杂交实验。混合使用特异性核酸连接(蜗牛)DNA探针定位感兴趣的mrna，用基因特异性条形码标记(图1A)。在下一步，蜗牛探针被循环和放大在原地,将胺修饰的核苷酸合并到扩增子中，使其稳定地交联到细胞蛋白基质上。为了定位这些条形码扩增子，我们使用了多轮杂交测序方法，每轮4个桥式探针与4个各自的DNA条形码杂交，然后每个桥式探针用4个不同的荧光探针中的一个标记(图1B)。在一个成像步骤中，使用标准共聚焦显微镜，四个不同的目标可以通过各自的荧光探针在四个不同的通道中被检测到。成像后，剥离探针，针对接下来四个DNA条形码的下一批桥和荧光探针进行杂交，以进行下一轮成像(图1C)。因此，随着每一轮的探测和成像，更多的转录本可以添加到详细的phytommap中^nyTM一个完整的根。

作者通过检测具有众所周知的表达模式的基因转录本来验证他们的方法，例如不同组织类型的标记，并从发表的scRNAseq数据集(Shahanet al。, 2022)。此外，他们通过在7轮杂交/成像/剥离中靶向28个基因，探索了该方法的多路复用能力。为了在一个完整的安装图像中对所有回合的图像进行组合分析，该团队开发了一个自动计算管道。为此，我们将所有图像注册为3D，基于细胞壁染色信息进行细胞分割，并将不同转录本的检测点分配到单个细胞。根据作者的观点，五个根之间的比较产生了高度鲁棒性和可重复性的数据，检测到不同生物样本之间每种RNA物种的转录本数量相当(见电影1)。数据可以可视化为统一廖形近似和投影(UMAP)，无需输入空间信息，集群代表主要的细胞类型和发育阶段。

为什么这个预印本很重要:

PHYTOMap^nyTM将允许研究人员在同一个生物样本中以单细胞分辨率对多个基因的表达进行空间和重复性的绘制，这是从scRNAseq数据中获得最大收益的必要工具。这样，在转录组学实验中发现的基因簇可以被分配到完整植物的特定组织和细胞组中。此外，对于拟南芥来说，整个流程可以以最小的时间和人工成本完成。实验工作在实验台上的时间与建立RNA的时间相似原位杂交方法(Stahl和Simon, 2010): 4-5天制备样品;对于成像，可以使用常规的共聚焦显微镜，每一轮成像大约需要3小时每个根尖或5小时每五个根尖。使用类似的方法，表明超过25轮新的桥探针和荧光探针是可能的，因此PHYTOMap^nyTM可能映射多达25 × 4 =100个基因(李et al。, 2015)。至于成本，有几家公司提供了可以在商业上获得的工具，将几个基因的表达映射到组织中，例如使用100倍的组合单分子荧光定位基因表达原位杂化。然而，这类商业服务的成本通常高达几千美元，因此许多研究小组负担不起。相比之下，对于一个28基因的PHYTOMap^nyTM根据作者的计算，这项实验的总成本大约为80美元，96个基因的成本为230美元，这使得广泛的研究人员都能负担得起这项实验。此外，通过使用完整的植物，任何由于组织切片造成的伪影或信息丢失都可以消除。

挑战和未来方向:

PHYTOMap的一个主要限制^nyTM到目前为止，它只在拟南芥的根尖上进行了测试。因此，主要的挑战在于如何将该技术应用于其他组织，甚至更重要的是，应用于其他植物物种，特别是非模式植物。的在活的有机体内使用(例如)荧光报告系对基因表达进行分析和验证通常是在拟南芥中进行的(虽然同时对1-4个基因进行分析，而不是1-100个基因)，但这对研究更复杂的植物的研究人员来说是一个重大挑战，因为这些植物不(容易)被转化。PHYTOMap^nyTM如果它真的能适应这些植物，就有可能极大地加速对这些植物的研究。然而，目前尚不清楚螺杆菌探针和染料穿透在相对小而细的根尖之外的其他组织中是否也同样有效，根尖的优势是内皮屏障形成不完全，有利于探针和染料进入血管系统。更复杂的根可能需要额外的分段步骤。对于大多数植物来说，RNA原位混合仍然基于石蜡包埋后的显微组织切片(Zöllneret al。， 2021)，这将导致少数细胞的扁平层，因此该方法的3D分辨率将丢失。对于这些部分，PHYTOMap^nyTM协议想必必须经过高度修改。另一种处理厚组织的方法是在不使用石蜡包埋的固定后用振动器将其切片，这种方法已用于全贴载RNA原位红枣组织杂交(肖et al。, 2019)。为此，只需在phytommap中进行轻微更改^nyTM协议可能足够了，而且3D分辨率将部分保持，因为section由多个细胞层组成。

第一作者Tatsuya Nobori也在Twitter上添加了一个线程来介绍phytommap^nyTM: https://twitter.com/nobolly/status/1553408840237846528

总之，植物的空间转录组学仍处于起步阶段，但植物图谱^nyTM由Nobori等．是朝着正确方向迈出的一大步。

图1:PHYTOMap^nyTM概念和成像结果。

一)phytommap的实验方法^nyTM用于探针杂交，结扎和扩增原位．B)通过探测、成像和剥离进行连续轮成像的杂交序列化学。C)设置成像轮(左)和拟南芥根尖在不同成像轮上的代表图像，使用四种不同的荧光探针(蓝、粉、绿、红)，显示相同位置z平面的最大曝光量(右)，比例尺30 μ修改自(Noboriet al。, 2022)。

电影1:通过对每个根的四个不同基因的映射来证明概念;显示的是根尖的三维投影。来自(Noboriet al。, 2022)。

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发布日期:2022年9月2日，更新日期:2022年9月5日

doi:https://doi.org/10.1242/prelights.32621

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