plak血红蛋白是naïve多能性的机械反应调节因子

蒂莫·n·科勒,约阿希姆•德•Jonghe安娜·l·埃勒曼Ayaka柳田,迈克尔·埃尔热艾琳·m·Slatery凯特琳•费舍尔卡拉·穆拉斯，艾利克斯·温克尔，康纳·罗斯，苏菲伯格曼,克里斯蒂安Franze,凯文•Chalut珍妮弗·尼克尔斯,托尔斯滕·e·Boroviak,Florian Hollfelder

预印本发布于2022年3月16日https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.03.13.484158v1

plak红蛋白的拯救:脊椎动物β-连环蛋白同源物如何在早期胚胎发生中感知机制以维持naïve多能性。

选择的Ilaria Di Meglio

类别:生物物理学，发育生物学

背景

来自外部环境的物理和化学刺激是发展的关键;它们决定了将单细胞转化为复杂的多细胞生物的过程(Heisenberg和Bellaiche, 2013)。甚至在植入之前，在胚胎发生的最早阶段，幼稚多能细胞必须整合这些线索，因为它们被导向特定的细胞命运(谱系规格)(Chan等人，2017,Vining和Mooney, 2017)。但我们仍然不完全了解机械信号是如何促成这一过程的。在naïve多能性过程中，像体积压缩和空间限制这样的物理线索是如何转化为转录变化的?涉及哪些机械敏感基因?

在他们的研究中，Kohler和同事通过研究naïve多能胚胎干细胞(ESCs)的转录和形态发展来解决这些基本问题，ESCs包裹在3D琼脂糖微凝胶中。利用这种方法，他们证明了体积限制对多能性的影响，并表明plak血红蛋白(一种脊椎动物β-连环蛋白的同源物)的表达对幼稚多能性是必需的。

重要发现

科勒等用球形琼脂糖微凝胶包裹小鼠esc (图1)．该系统允许作者解决他们的问题，因为小鼠esc捕获naïve多能性在体外微凝胶提供了一种三维培养支架，可以模拟发育中的胚胎细胞所经历的体积限制。一旦产生，微凝胶在以下两种培养基中培养:2i/LIF培养基的自我更新条件，无限期维持naïve的多能性;血清/LIF的自我更新条件，支持亚稳态;或N2B27培养基中诱导细胞分化的条件。使用naïve (KLF4)和general (OCT4)多能性标记来确认这些条件。因此，多能性标记在自我更新条件下表达，转移到分化条件2天后，KLF4和OCT4分别表达下调和缺失。为了评估3D培养对ESCs的影响，Kohler和同事利用报告细胞系Rex1::GFPd2(以下简称RGd2细胞)作为细胞naïve多能性的定量和实时测量指标。在2i/LIF培养基中均匀的GFP信号表明多能naïve，而N2B27表达缺失表明多能naïve退出。因此，3D琼脂糖微凝胶适用于幼稚多能性esc的培养。

为了评估3D微凝胶对转录的影响，作者比较了3D微凝胶和2D组织培养的naïve ESCs的基因表达数据。除了naïve多能性标记在3D中的全球增长外，最显著的差异表达基因包括Wnt/β-catenin信号通路的组成部分Jup．的基因Jup编码plak红蛋白，脊椎动物的β-连环蛋白的同源物。对β-连环蛋白正常定位的细胞-细胞粘附连接(AJs)相关基因的分析证实了这一点Jup在AJs的增长最为强劲。同样，对AJs上的细胞粘附蛋白的免疫荧光分析证实，plak血红蛋白在3D微凝胶中定位于AJs，而不是在2D中，而β-catenin在两种微凝胶中都表达，但在2D中更高(图1 b)．

图1 | ESC包埋于3D微凝胶中可促进细胞的表达β连环蛋白同系物,Plakoglobin
一个。用微流控技术在三维微凝胶中封装ESCs的示意图。b。2D培养与3D微凝胶的plak血红蛋白(左)和β-连环蛋白(右)的免疫荧光图像和定量。

重要的是，作者还将他们的发现与悬挂培养进行了比较，悬挂培养是在一个没有限制的三维环境中生长的esc。该培养系统将允许他们确认所观察到的影响是由于三维微凝胶的体积限制，而不仅仅是三维环境。他们发现，β-连环蛋白在两种情况下都被观察到，而plak血红蛋白仅在3D微凝胶中被上调。即使在48小时后将ESCs从3D微凝胶中释放并转移到悬滴培养的情况下，plak血红蛋白的表达也消失了。这证实了3D微凝胶产生的体积限制对plak血红蛋白的表达是必需的。

为了证实naïve多能性和plak血红蛋白之间的联系在活的有机体内科勒和同事们还分析了人类和老鼠的胚胎．与他们在naïve ESCs中的发现一致，他们发现高表达的Jup在着床前小鼠胚胎中，当naïve多能性建立时。在蛋白水平上，plak血红蛋白的表达与囊胚腔的扩张有关。虽然很难评估体内,这些观察结果表明，腔扩张导致的压力增加可能提供了调控血小板红蛋白的机械信号。

如果3D微凝胶能促进plak血红蛋白的表达以维持多能性，那么外源性过表达plak血红蛋白是否能模拟3D微凝胶培养的效果?为此，科勒等产生plak血红蛋白过表达细胞，获得plak血红蛋白低表达或高表达的克隆ESC系。超表达的外源性Jup通过mCherry(通过Jup-2A-mCherry)和GFP多能性(通过Rex1::GFPd2)。使用低表达和高表达plak红蛋白的细胞系表明，在亚稳态条件下(血清/LIF)， plak红蛋白的高表达需要保持组织形态和与初始多能相关的均匀GFP表达。因此，在亚稳态培养条件下，plak血红蛋白的高表达可以稳定naïve的多能性。

最后，Kohler和同事想知道plak血红蛋白是否可以独立于β-连环蛋白保持naïve的多能性。为此，他们分析了在两种条件下表达plak血红蛋白的细胞:XAV处理，一种阻断β-catenin核信号的药物，以及敲除plak血红蛋白表达细胞中的β-catenin。在这两种情况下，细胞都保持了naïve的多能性。因此，plak血红蛋白可以独立于β-连环蛋白维持naïve的多能性。这一证据以及小鼠esc在3D琼脂糖微凝胶中的封装，让作者证明体积压缩是通过plak红蛋白激活分子信号的上游机械信号。这可能发生在活的有机体内随着囊胚腔内的膨胀产生压力(机械信号)来调节naïve的多能性。

为什么我选择这个预印本

我选择这个预印本，是因为我真的很喜欢读它，也因为它是关于力之间相互作用的全面研究，一个机械敏感的分子(plak血红蛋白)，以及这个链接在naïve多能性中的关键作用。作者提供了详尽的(和补充的)证据来支持他们的主要主张，包括形态学和转录数据在体外3 d文化和在活的有机体内在老鼠和人类胚胎中。这项研究也为3D系统完全取代2D文化系统铺平了道路(并强调了必要性)在体外研究的发展。

参考文献

海森堡，C.P.＆Bellaiche，Y．组织形态发生和模式形成中的力量。细胞,153年,948 - 62(2013)。

陈，C.J.，海森堡，C.P.＆Hiiragi，T．发育中形态发生与细胞命运规范的协调。现代生物学,27日,R1024-R1035(2017)。

机械力量直接影响干细胞在发育和再生中的行为。分子细胞生物学18，728 - 742(2017)。

发布日期:2022年5月23日

doi:https://doi.org/10.1242/prelights.31979

读预印本

（1票)

问题:＊
你的名字:＊
你的电子邮件:＊

细节:＊

作者的回应

蒂莫·科勒共享

您认为在这个发展阶段，plak血红蛋白取代β-连环蛋白的必要性是什么?plak血红蛋白的高表达是否可以直接抑制β-连环蛋白(这是分化所必需的?)来维持naïve的多能性?

这是一个很好的问题!阐明plak血红蛋白在naïve多能性建立过程中外胚层短暂出现的发育机制是我们的最终目标。虽然我们已经证明在胚胎干细胞中plak血红蛋白和b -连环蛋白水平呈负相关，但我们不知道在胚胎发育过程中是否也是如此。众所周知，b - catenin和plak血红蛋白以相互排斥的方式结合E - cadherin，并且在植入前的上皮细胞中不存在桥粒。因此，人们可能会推测，plak血红蛋白可能会从膜中释放b -连环蛋白，并导致其降解或其核转位，用于后续的信号转导。然而，也有可能形成新的附加粘附连接或plak血红蛋白被纳入到迄今未知的蛋白复合物中——这两种情况下膜结合b -连环蛋白不会受到影响。

要知道诱导plak血红蛋白表达需要多少压缩是很有趣的。你是否对这种压缩进行了量化(也许是通过测量微凝胶的变形)?

由于微凝胶的流动性，在这个系统中测量力本身就很棘手。我们正在探索几种方法，包括固定化微凝胶以实现牵引力显微镜，嵌入聚丙烯酰胺珠作为压力传感器(Dolega等人，2017)或改变微凝胶的刚度。由于微凝胶介导的约束也可能影响膜张力，我们有兴趣尝试激光烧蚀膜标记封装细胞。最后，我们与Evorion生物技术公司的合作者一起，正在研究一种微流体培养箱，用于微凝胶包裹的细胞，然后可以对其加压，从而使我们能够更精确地操纵与调控plak血红蛋白有关的力量。

您如何(定量)评估plak血红蛋白是否发挥机械反应作用在活的有机体内?

Chan和同事最近通过机械方式对小鼠植入前胚胎充气和放气，以调节囊胚腔的静水压力(Chan等人，2019年)。这种方法——或者是各种可用的药物治疗——可以用来改变人体的生物物理微环境在活的有机体内研究其对plakhemoglobin的影响。此外，我们还计划在凝胶中培养早期囊胚，包括透明带和不透明带，类似于微凝胶系统中胚胎干细胞的空间限制。

参考文献

Dolega, M.， Delarue, M.， Ingremeau, F.等。细胞样压力传感器显示，在压缩下，多细胞球体的核心机械应力增加。Nat通讯8,14056(2017)。

Chan c.j.， Costanzo, M.， Ruiz-Herrero, T.等。哺乳动物胚胎大小和细胞命运的水力控制。Nature 571,112 - 116(2019)。